ABSTRACT
O pulgão-verde-dos-cereais, Schizaphis graminum Rondani, é uma das mais importantes pragas de cereais no mundo. Nas populações dessa espécie, podem ser separados vários biótipos, que são clones que compartilham a mesma relação de virulência com plantas cultivadas. Visando diminuir custos e aumentar a rapidez na identificação de biótipos, marcadores moleculares têm sido bastante utilizados para caracterizar geneticamente populações. Com o propósito de encontrar marcadores RAPD para identificar biótipos de S. graminum, dezenove populações clonais de três biótipos (B, C e E) do Brasil e três populações clonais oriundas dos Estados Unidos foram examinadas. Dezoito oligonucleotídeos iniciadores foram utilizados para a análise dos clones coletados para este estudo. Apenas seis oligonucleotídeos iniciadores revelaram polimorfismos e dentre estes, apenas três foram diagnósticos para discriminar os três biótipos. Utilizando o índice de similaridade de Jaccard e agrupamento por UPGMA, foi demonstrado que o biótipo B é geneticamente distinto de C e E, e estes são muito relacionados entre si. O biótipo C foi o que apresentou maior diversidade, enquanto que o biótipo E foi o menos diverso. Análise da Variância Molecular (AMOVA) mostrou que populações clonais pertencentes à mesma categoria biotípica têm menor variância genética do que populações clonais agrupados conforme a similaridade geográfica.
The greenbug Schizaphis graminum (Rondani) is one of the most important cereals pests in the world. Within populations of this species, several biotypes, which are clones that share same virulence relationships with cultivated plants, can be distinguished. Molecular markers have been used to genetically characterize insect populations because they are fast and cost effective. In order to find RAPD markers to identify Brazilian S. graminum biotypes, nineteen clonal populations of three biotypes (B, C and E) from Brazil and three clonal populations from the U.S. were examined. Eighteen primers were used to analyze the material, but only six primers revealed polymorphisms and among those, three produced diagnostic band profiles that allowed biotype characterization. Using Jaccard Similarity Index and UPGMA clustering method it was possible to show that biotype B is genetically very distinct from C and E, which are closely related to each other. The biotype C showed the greatest genetic diversity, while biotype E was the least diverse. Analysis of Molecular Variance (AMOVA) showed that genetic variance among clonal populations belonging to the same biotype is smaller than among clonal populations grouped according to their geographical similarity.
ABSTRACT
Studies were carried out to optimize the conditions for transient gene expression through particle bombardment on Carrizo citrange (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) thin epicotyl sections. The best conditions for transient GUS expression were: M-25 tungsten particles, 1550 psi helium pressure, 9 cm distance between specimen and DNA/particle holder and culture of explants in a high osmolarity medium (0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol) 4 h prior and 20 h after bombardment. Under these conditions, an average of 102 blue spots per bombardment (20 explants/plate) were achieved. This protocol is currently being used for transformation of Carrizo citrange and sweet orange (Citrus sinensis)
ABSTRACT
PCR-RAPD has been widely used for genetic analysis in several organisms. However, due to complex interactions among the components of the PCR reaction it is unlikely that a single amplification condition can be suitable for all situations. In order to determine the optimum conditions for using PCR-RAPD in taxonomical analyses of the genus Atta, the following factors were tested: concentrations of MgCl2, DNA, BSA, cycling programs and methods of DNA extraction, using Fractional Factorial Design and Central Composite Design. DNA extraction methods had little influence on PCR-RAPD reactions, while the cycling programs showed the largest effect. The MgCl2 concentration was less important than the amount of DNA used in the reaction. Using cycling program P2, a significant improvement in the number of DNA fragments was achieved when MgCl2 concentration was increased to 3.0 mM and the BSA and DNA concentrations were reduced from 0.1 percent to 0.05 percent and from 2 to 1 ng/mul, respectively. The optimum conditions for PCR-RAPD with Atta specimens obtained in this study were: 25 mul reaction with 10 mM Tris-HCl (pH 9.0), 3.0 mM MgCl2, 50 mM KCl, 100 muM of each dNTP, 0.2 muM of primer, 1.0 U of Taq polymerase, 25 ng template DNA (extracted by Cheung's method) and BSA 0.05 percent, using the amplification program which consisted of 3 min at 94°C, 3 min at 35°C, followed by 40 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 36°C and 2 min at 72°C, and a 5 m final extension at 72°C.
A técnica PCR-RAPD tem sido amplamente empregada em estudos genéticos de populações de vários organismos. Entretanto, devido às interações entre os componentes da reação de PCR é improvável que uma única condição de amplificação possa ser adequada para todas as situações. Com o objetivo de determinar as condições ótimas para a utilização da técnica PCR-RAPD em análises taxonômicas do gênero Atta, foram analisados os fatores: concentrações de MgCl2, DNA, BSA, programas de temperaturas e métodos de extração de DNA, utilizando-se os delineamentos Fatorial Fracionado e o Central Composto. Dentre os fatores avaliados, o método de extração de DNA teve pouca influência na reação, enquanto que o programa de temperatura apresentou o maior efeito. Embora a concentração de MgCl2 seja importante para obtenção de um padrão exato de bandas, seu efeito foi menor do que a quantidade de DNA. Com o aumento da concentração de MgCl2 para 3,0 mM e com a diminuição da concentração de BSA de 0,1 por cento para 0,05 por cento e da quantidade de DNA de 2 para 1 ng/mil ocorreu um aumento significativo no número de fragmentos amplificados, sendo esse efeito observado com maior evidência no programa P2. As condições ótimas estabelecidas para as reações PCR-RAPD foram: 25 mil de solução contendo 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 100 miM de cada dNTP, 0,2 miM de primer, 1,0 U de Taq polimerase, 25 ng DNA (extraído pelo método Cheung) e BSA 0,05 por cento, utilizando-se o programa de amplificação: 3 min. a 94°C, 3 min. a 35°C, seguidos de 40 ciclos de 1 min. a 94°C, 1 min. a 36°C e 2 min. a 72°C, com extensão final de 5 min. a 72°C.